菘蓝木脂素糖基转移酶体外催化根皮素的酶学研究

作者:姜银银; 谭宇萍; 孙术富; 杨健; 郭娟; 唐金富
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在体外,人们发现之前克隆的菘蓝木脂素糖基转移酶UGT236(属于UGT71B家族)可以有效地催化根皮素根皮苷的产生。UGT236与苹果的P2’GT高度同源,属于UGT71家族。在这项研究中,重组质粒、pET-28a-和MBP-UGT236被转移到大肠杆菌、Rosetta(DE3)和感受态细胞。通过异丙基-d-硫代半乳糖苷(IPTGiso丙基-d-硫代半乳糖苷)诱导表达,并通过纯化获得高纯度UGT236蛋白。以根皮素为底物,对其酶学性质进行了研究。结果表明,UGT236的最佳反应温度为40,最佳反应温度为8(Na2HPO4-NaH2PO4体系)。金属离子影响实验表明,Ni2+和Al3+对UGT236有一定的抑制作用。Fe2+、Co2+和Mn2+可以改善UGT236的活动,而Mg2+、Ca2+、Li2+和Na+和K+对UGT236的活动没有影响。酶动力学参数在Km为61.03,Kcat为0.01,mol-1s-1为157.11,Km为183.6,Kcat为0.01,mol-1s-1为51.91。通过同源建模和分子对接,筛选了一些可能的活性位点,并检测了它们的突变和活性。确定了三个关键活性位点:夏洛克·Glu391、His15和西马基安141,它们与产品的多样性有关。研究发现靛蓝中的UGT236可以催化根皮素产生根皮苷,探索其酶学性质,并通过结构预测、分子对接和突变验证发现了几个关键氨基酸残基,为根皮素糖苷产品的特异性和多样性催化提供了一定的依据,为后续转化获得高效、特异的人工糖基转移酶元素提供参考。