【目的】南京椴是江苏省重要的乡土树种，野生资源稀缺。南京椴野生种群遗传多样性和遗传结构的探索将为资源保护、品种选育和遗传改良提供基础。[方法]以南京椴（miquelianaTilia）5个自然群体的93个个体（宝华山、江苏P1、牛首山P2、皇藏峪、安徽P3、蜀山、P4、安徽P3和天台山、浙江P5）为实验材料，选择15对多态性EST-SSR引物，分析遗传多样性和群体结构。[结果]15对引物共检测到等位基因（a）96个，平均值为6.4。四倍体基因型（g）和四倍体特异基因型（Gi）的总数分别为441和251。特异基因型（P1）和种质（P2）的平均比例分别为45.73%和17.99%。在这五个群体中，每个位点的ALOC和平均四倍体基因型丰富度（Gloc）分别为5.502.43和9.414.29），杂合度（He）的平均期望值分别为0.611.43和0.620.14。参考每个人口的格洛克值和He值，确定具有高遗传多样性的群体为P1和P3。群体间的遗传分化很小，在遗传分化系数只有0.030（Gst）。AMOVA分子变异分析表明，种群多样性水平的变异来自种群内部（96%）。聚类分析和Structure分析表明，这五个组可分为两组（第一组：P1、P2和P5。第二组：P3和P4）。Mental试验表明，遗传距离和地理距离之间没有显著相关性。[结论]南京椴种群具有丰富的遗传多样性，其中宝华山和皇藏峪种群的遗传多样性较高。人口扩张可能以这两个人口为中心，并通过人类活动迁移到其他地区。然而，南京椴种群之间没有明显的分化，主要是由于植物寿命长，种群缺乏自然更新，以及种群之间存在人工种子传播。因此，本研究建议建立隔离区，明确优先保护群体，增加植物异交，通过人工育种和种质迁移保护田间群体。